TalTechi küberneetika instituudi täisprofessor Marko Vendelini sõnul hakkas FCS esile tõusma 1990. aastatel konfokaalmikroskoopide kättesaadavaks muutumisega. „Sellest ajast alates on seda aktiivselt kasutatud keemiliste reaktsioonide, agregaatide moodustumise, molekulide liikumise rakkudes ja molekulide kinnitumise membraanidele uurimiseks ühe molekuli tasandil.“  Selline molekulaarsel tasandil protsesside sügavam mõistmine võimaldab teadlastel kavandada ravimeid, avastada uusi rakusiseseid interaktsioone ja arendada materjale viisil, mis muidu oleks võimatu või väga keeruline.

Uus läbimurre Eesti teadlastelt
Hiljuti avaldas Eesti teadlaste töörühm TalTechi küberneetika instituudi süsteemibioloogia laboratooriumist uuringu, mis võib revolutsiooniliselt muuta FCS-is kasutatud mõõtmiste analüüsimise viisi ja lahendada ühe selle lähenemisviisi peamise nõrkuse. „Selleks kasutasime võimsaid arvutusvahendeid, mis olid algselt loodud tehisintellekti jaoks, kuid AI „mustade kastide” meetodite asemel rakendati  neid vahendeid läbipaistvate, füüsikalistel alustel põhinevate mudelite optimeerimiseks,“ tutvustab uurimist lähemalt professor Vendelin.

Et selgitada, mis on saavutatud ja miks see oluline on, peame kõigepealt tutvustama FCS põhitõdesid. FCS tööpõhimõte seisneb andmete salvestamiselt väga väikesest ruumalast – umbes femtoliitrist (üks kvadriljonikümmend liitrit, mis on kui üks liivaterake olümpiabasseinis). Klassikalises vormis kasutab FCS konfokaalmikroskoopi. Konfokaalmikroskoobis suunatakse laser proovile, olgu see siis rakk või muu objekt, ja signaal kogutakse ainult väga väikesest vaatlusruumalast laseri fookuses. FCS-i kasutatakse, kui selles ruumalas on vaid mõni molekul, mis võib fluorestseeruda – omadus, mis võimaldab teatud molekulidel kiirata valgust, kui neid ergastavad footonid.

Niivõrd väikese molekulide arvu puhul muutub signaal väga müraseks. Siiski on võimalik seostada signaali suurenemist molekulide saabumisega mikroskoobi fookusesse, muutumisega keemiliste reaktsioonide kaudu või pinnale kinnitumisega. Põhimõtteliselt võib uurida kõike, mis muudab fluorestsentsi, seostades seda mõne füüsilise protsessiga, nagu liikumine või reaktsioon.

Kuidas FCS töötab?
FCS signaalitöötluse põhimõtete mõistmiseks vaatleme ühte elulist näidet. Kujutage ette, et soovite teada saada, kas üks kassapidaja töötab poes kiiremini kui teine. Üks võimalus on lasta töötada ainult ühel neist ja vaadata, kui kiiresti nad suudavad teenindada pikka kliendijärjekorda. See eksperiment oleks küll lihtne, kuid tulemuseks oleks suur hulk rahulolematuid kliente. Teine võimalus on lasta mõlemal kassapidajal töötada vaiksel ajal, kui kliente on vähe, ja märkida üles, millal iga klient kassasse saabub ja sealt lahkub. Keskendudes ainult iga kassapidaja ümbrusele, saame määrata kliendi teenindamise keskmise aja ja kas kassapidajad töötavad erineva kiirusega. Sarnaselt näitega saab FCSi kasutades tuletada molekulide omadusi, näiteks nende liikumiskiiruse,  jälgides, millal molekulid sisenevad ja lahkuvad vaatlusruumist ehk mõõdetud fluorestsentssignaal vastavalt suureneb ja väheneb.

Autokorrelatsioon ja selle statistiline probleem
Kuigi kliente saame jälgida üsna lihtsalt, siis töötamine molekulaarsel tasemel tekitab koheseid probleeme halva signaali kvaliteedi tõttu. Molekulid ei eralda alati footoneid, paljud footonid jäävad märkamata ja soovimatud signaalid võivad segada —muutes andmed väga müraseks. Selle ületamiseks mõõdab FCS väga kiiresti (iga mikrosekundi järel) ja korduvalt, kogudes palju andmeid analüüsimiseks. Selgub, et üks väga kasulik viis, kuidas sellisest mürarikkast signaalist midagi analüüsitavat välja võtta, on arvutada signaali autokorrelatsioon. Põhimõtteliselt näitab autokorrelatsioon, kui suur on tõenäosus, et mõne aja möödudes näeb veel tugevnenud signaali, kui varem on täheldatud fluorestsentsi tõusu. Tõepoolest, kui vaatlusruumalasse siseneb suur ja aeglaselt liikuv molekul, jääb signaal tugevaks seni, kuni molekul sealt eemaldub. Analüüsides neid autokorrelatsioone, saame kindlaks teha, kui kiiresti molekulid liiguvad.

Aastate jooksul on FCS-i areng õpetanud meid lugema autokorrelatsioone nagu sõrmejälgi, mis paljastavad, kas näeme lihtsat molekulide liikumist, keemilisi reaktsioone või eri suurusega osakesi. Siiski on autokorrelatsioonide analüüsimisega seotud üks suur statistile iseloomuga probleem. Nimelt, kuna kõik autokorrelatsiooni väärtused pärinevad ühest ja samast katsest, need ei ole tõeliselt sõltumatud mõõtmised. Selle mõistmiseks kujutage ette, et mõõdate ühe päeva jooksul iga minuti järel temperatuuri ja küsite: „Kui sarnane on praegune temperatuur sellega, mis oli üks tund tagasi? Kaks tundi tagasi? Neli tundi tagasi?” Iga võrdlus annab teavet temperatuurimustrite kohta. Antud mustrist selgub isegi, kas päev oli päikeseline või pilvine. Kuid kuna kõik need sarnasusmõõtmised pärinevad samast temperatuuriandmestikust, ei ole need statistiliselt sõltumatud. Selle tulemusena ei saa järelduste usaldusväärsust õigesti hinnata – võib arvata, et on tugev tõendusmaterjal ilmastikunähtuste kohta, kuid tegelikult on saada vaid ühe päeva andmed, mida on analüüsitud mitmel viisil. Samamoodi, FCS-is, kuigi iga autokorrelatsiooniväärtus erinevate ajaliste viivitustega annab teavet molekulide käitumise kohta, on need kõik arvutatud sama fluorestsentsandmete kattuvate osade põhjal.

Ebamugavad valikud ja ebaõnnestunud katsed
Nagu mitmed uurimisrühmad on näidanud, peaksid eksperimendid nende autokorrelatsioonide õigeks analüüsimiseks olema palju pikemad, kui see on praktiline või isegi võimalik. Eksperimendi kestus on lõppkokkuvõttes piiratud sellega, kui palju laserkiirgust rakk või muu objekt talub, ning elusrakkude puhul on see aeg üsna piiratud. 

See tekitab ebamugava valiku: kas kasutada FCS-i ebakorrektselt või üldse mitte uurida süsteemi.
Umbes kuus aastat tagasi pakkus üks USA uurimisrühm välja alternatiivse lähenemisviisi: jätta analüüsist välja autokorrelatsioon ja kasutada matemaatilisi mudeleid, mis töötavad otse müra sisaldavate eksperimentaalsete andmetega, et saada sama teave kui FCS-ist. Nende eesmärk oli lühendada eksperimendi aega. Nagu paljud teisedki, oli ka TalTechi süsteemibioloogia labor sellest lähenemisviisist väga huvitatud ja soovis seda rakendada molekulide liikumise uurimiseks südamelihasrakkudes. Paraku selgus, et algne rakendus oli väga aeglane ja äärmiselt tundlik mudeli parameetrite suhtes, näiteks teadlase hinnangu molekuli omaduste kohta. Selline tundlikkus võib viia valede vastuste saamiseni või vastuste leidmata jäämiseni. Seega, kuigi müra sisaldavate FCS-andmete otsese analüüsimise idee oli väga ahvatlev, eriti kuna see võimaldaks vältida traditsioonilist FCS-i vaevavaid statistiliste andmete töötlemise probleeme, oli selle rakendamisel palju praktilisi probleeme.

FITSA – vähem andmeid ja töökindlam
Oma hiljutises uuringus avaldas süsteemibioloogia labori  teadlaste rühm uue meetodi, mis põhineb varem välja pakutud fluoresentssignaali vahetul analüüsil ideel, seljatades paljud varasema rakenduse käigus esinenud probleeme. “Näitasime, et uus fluoresentsi intensiivsuse aegrea statistilise analüüsi (FITSA) meetod on töökindel ega nõua enne katse läbiviimist molekulide omaduste täpset tundmist,” selgitab labori juht professor Vendelin.

Eriti huvitav on analüüs selle kohta, kui palju vähem andmeid on vaja molekulaaromaduste hindamiseks FITSA abil võrreldes klassikalise FCS-iga. Isegi kui FCS-i kasutati eirates autokorrelatsiooni statistilisi omadusi, vajas FITSA mitu korda vähem andmeid kui FCS. Võrreldes FCS-iga vajab FITSA lausa 300 kuni 21000 korda vähem andmeid sama tulemuse saamiseks, kui FCSi kasutaks õigesti. Selline tohutu vajaminevate katseandmete hulga vähenemise tõttu avab FITSA uusi võimalusi nende protsesside uurimiseks, mis olid varem võimatud.

Revolutsiooniline avastus meditsiinis ja materjaliteaduses
Teadlased arvavad, et FITSA ja sarnastel lähenemistel põhinevad meetodid asendavad tulevikus klassikalise FCS analüüsi kõikides rakendustes. Praegu on veel vaja lahendada mitmeid praktilisi probleeme, kuid FITSA on näidanud, et eksperimentaalsete andmete otsene analüüs annab suure eelise. Edasiste arengutega võimaldab see meil uurida rakusisest keskkonda ja molekulaarseid interaktsioone palju täpsemalt.

Uue meetodi mõju võib olla murranguline, leiab lõpetuseks professor Vendelin. „Kujutlege, et saate kiiresti sõeluda tuhandeid potentsiaalseid uusi ravimeid, jälgides nende molekulaarset käitumist elusrakkudes.“ FITSA võimaldab teadlastel uurida rakkude protsesse, mis varem nõudsid liiga pikki katseid, muutes potentsiaalselt revolutsiooniliselt meie arusaama kõigest alates südamehaigustest kuni uute materjalide arendamiseni.

Artikkel ilmus ajakirjas Science Advances.
Teadustöö toetatud ETAg PRG1127.